Antony fanelingelenana amin'ny fanehoan-kevitry ny PCR

Mandritra ny fihetsiketsehan'ny PCR dia matetika misy ny anton-javatra manelingelina.
Noho ny fahatsapan'ny PCR avo dia avo, ny fandotoana dia heverina ho iray amin'ireo lafin-javatra manan-danja indrindra misy fiantraikany amin'ny valin'ny PCR ary mety hiteraka vokatra tsara diso.
Mitsikera ihany koa ireo loharanom-baovao isan-karazany izay mitondra vokatra ratsy diso. Raha misy ampahany tena ilaina amin'ny fangaro PCR na ny fanehoan-kevitry ny amplification mihitsy no voasakana na voasakana, dia mety ho voasakana ny fitiliana diagnostika. Izany dia mety hitarika amin'ny fihenan'ny fahombiazana ary na dia ny vokatra ratsy diso aza.
Ho fanampin'ny fanakanana, mety hitranga ny fahaverezan'ny asidra nokleika kendrena noho ny fepetra fandefasana sy/na fitahirizana alohan'ny fanomanana santionany. Indrindra indrindra, ny hafanana ambony na ny fitehirizana tsy ampy dia mety hiteraka fahasimban'ny sela sy ny asidra nokleika. Ny fametrahana ny sela sy ny tavy ary ny fametahana paraffine dia fantatra tsara amin'ny fiparitahan'ny ADN ary olana maharitra (jereo ny sary 1 sy 2). Amin'ireny tranga ireny, na dia ny fitokanana sy ny fanadiovana tsara indrindra aza dia tsy hanampy.

Sary 1 | Ny fiantraikan'ny immobilization amin'ny fahamendrehan'ny ADN
Nasehon'ny electrophoresis gel agarose fa miovaova be ny kalitaon'ny ADN natokana ho an'ny fizarana paraffine amin'ny autopsies. Ny ADN amin'ny halavan'ny sombintsombiny isan-karazany dia hita tao amin'ny fitrandrahana miankina amin'ny fomba fanamboarana. Ny ADN dia voatahiry raha tsy voatahiry ao amin'ny santionany mangatsiaka mangatsiaka sy amin'ny formaline neutre buffered. Niteraka fahaverezan'ny ADN ny fampiasana ny Bouin fixative mafy na tsy voafehy, misy formaline misy asidra formika. Mizarazara be ny ampahany sisa.
Eo ankavia, ny halavan'ny sombiny dia aseho amin'ny tsiroaroa kilobase (kbp)

Sary 2 | Ny fahaverezan'ny fahamendrehan'ny kendrena asidra nokleika
(a) Ny elanelana 3′-5′ eo amin'ireo kofehy roa dia hiteraka fahatapahan'ny ADN kendrena. Mbola hitranga amin'ny sombiny kely ihany ny synthesis ny ADN. Na izany aza, raha toa ka tsy hita ao amin'ny sombin-tsarin'ny ADN ny toerana fanaovana annealing voalohany, dia ny fanamafisam-peo ihany no mitranga. Amin'ny toe-javatra tsara indrindra, ny sombintsombiny dia mety hifamatotra indray, fa ny vokatra dia ho kely ary ambany ny haavon'ny fitiliana.
b) Ny fahaverezan'ny fotony, indrindra noho ny fiforonan'ny dimère thymidine sy ny depurination, dia miteraka fihenan'ny isan'ny fatoran'ny H ary mihena ny Tm. Mandritra ny dingan'ny fanamafisam-peo lava, ny primer dia hiempo hiala amin'ny ADN matrix ary tsy hikorontana na dia ao anatin'ny fepetra tsy dia henjana aza.
(c) Ny fototry ny thymine mifanila dia mamorona dimer TT.
Ny olana mahazatra iray hafa izay mitranga matetika amin'ny diagnostika molekiola dia ny famoahana tsy dia tsara loatra ny asidra nokleika kendrena raha oharina amin'ny fitrandrahana phenol-chloroform. Amin'ny toe-javatra faran'izay mafy dia azo ampifandraisina amin'ny ratsy diso izany. Betsaka ny fotoana azo vonjena amin'ny alàlan'ny lysis mangotraka na ny fandevonan-kanina amin'ny fandevonan-kanina sela, saingy matetika io fomba io dia miteraka fahatsapan'ny PCR ambany noho ny tsy fahampian'ny famoahana asidra nokleika.

Fanakanana ny hetsika polymerase mandritra ny amplification

Amin'ny ankapobeny, ny inhibition dia ampiasaina ho toy ny foto-kevitry ny fitoeran-javatra mba hamaritana ny anton-javatra rehetra izay mitarika ho amin'ny vokatra PCR suboptimal. Amin'ny heviny ara-biochemika hentitra, ny fanakanana dia voafetra amin'ny asan'ny anzima, izany hoe, mampihena na manakana ny fiovan'ny vokatra substrate amin'ny alàlan'ny fifandraisana amin'ny toerana mavitrika amin'ny ADN polymerase na ny cofactor azy (oh: Mg2+ ho an'ny Taq DNA polymerase).
Ny singa ao amin'ny santionany na ny buffer isan-karazany sy ny fitrandrahana misy reagents dia afaka manakana mivantana ny anzima na mamandrika ny cofactors ao aminy (ohatra EDTA), ka tsy mihetsika ny polymerase ary mitarika ho amin'ny fihenan'ny vokatra PCR ratsy na diso.
Na izany aza, ny fifandraisana maro eo amin'ny singa fanehoan-kevitra sy ny asidra nokleika misy kendrena dia voatondro ho 'inhibitor PCR'. Raha vantany vao simba ny fahamendrehan'ny sela noho ny fitokana-monina ary navoaka ny asidra nokleika, dia mety hitranga ny fifandraisana misy eo amin'ny santionany sy ny vahaolana manodidina azy ary ny dingana mafy. Ohatra, ny 'scavengers' dia afaka mamatotra ny ADN tokana na tady roa amin'ny alàlan'ny fifandraisana tsy misy covalent ary manelingelina ny fitokana-monina sy ny fanadiovana amin'ny fampihenana ny isan'ny tanjona tonga any amin'ny sambo fanehoan-kevitra PCR.
Amin'ny ankapobeny, ny PCR inhibitors dia hita ao amin'ny ankamaroan'ny tsiranoka amin'ny vatana sy ny reagents ampiasaina amin'ny fitsapana diagnostika klinika (urea amin'ny urine, hemoglobin ary heparin ao amin'ny ra), fanampin-tsakafo (singa organika, glycogène, tavy, ion Ca2+) ary singa ao amin'ny tontolo iainana (phenols). , metaly mavesatra)

Ny inhibitors PCR miely patrana kokoa dia hita ao amin'ny bakteria sy sela eukaryotic, ADN tsy lasibatra, macromolecules ADN amin'ny matrices sela ary fitaovana laboratoara toy ny fonon-tanana sy plastika. Ny fanadiovana ny asidra nokleika mandritra na aorian'ny fitrandrahana no fomba tsara indrindra hanesorana ireo inhibitors PCR.
Amin'izao fotoana izao, ny fitaovana fitrandrahana mandeha ho azy isan-karazany dia afaka manolo ny protocols maro, fa ny fanarenana 100% sy/na ny fanadiovana ny tanjona dia tsy mbola tratra. Mety mbola misy inhibitors mety hisy ao amin'ny asidra nokleika voadio na mety efa nisy vokany. Misy paikady samihafa mba hampihenana ny fiantraikan'ny inhibitors. Ny fisafidianana ny polymerase mety dia mety hisy fiantraikany lehibe amin'ny asan'ny inhibitor. Ny fomba hafa voaporofo hampihenana ny fanakanana PCR dia ny fampitomboana ny fifantohana polymerase na ny fampiasana additives toy ny BSA.
Ny fanakanana ny fanehoan-kevitry ny PCR dia azo aseho amin'ny fampiasana ny fanaraha-maso ny kalitaon'ny dingana anatiny (IPC).
Tsy maintsy atao ny fitandremana mba hanesorana ny reagents rehetra sy ny vahaolana hafa ao amin'ny kitapo fitrandrahana, toy ny ethanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol ary phenol, avy amin'ny asidra nokleika mitoka-monina amin'ny dingana fanasan-damba. Miankina amin'ny fifantohana azy ireo dia mety hampavitrika na hanakana ny PCR izy ireo.