Ireo anton-javatra manelingelina amin'ny fihetsiky ny PCR

Mandritra ny fihetsiky ny PCR dia matetika misy anton-javatra manelingelina.
Noho ny fahatsapana avo dia avo amin'ny PCR, ny fahalotoana dia heverina ho iray amin'ireo anton-javatra manan-danja indrindra misy fiantraikany amin'ny valin'ny PCR ary mety hiteraka vokatra diso tsara.
Zava-dehibe mitovy amin'izany koa ireo loharano isan-karazany izay mitarika ho amin'ny valiny diso-negatif. Raha voasakana na voasakana ny ampahany iray na maromaro amin'ny fangaro PCR na ny fihetsiky ny fanamafisana, dia mety ho voasakana ny fitiliana diagnostika. Mety hiteraka fihenan'ny fahombiazana izany ary mety hiteraka valiny diso-negatif mihitsy aza.
Ankoatra ny fanakanana, mety hitranga ny fahaverezan'ny fahamarinan'ny asidra nokleika kendrena noho ny fandefasana sy/na ny fitahirizana alohan'ny fanomanana ny santionany. Indrindra indrindra, ny mari-pana avo na ny fitahirizana tsy ampy dia mety hiteraka fahasimban'ny sela sy ny asidra nokleika. Ny fikikisana sela sy ny sela ary ny fampidirana paraffine dia antony fantatra tsara amin'ny fahapotehan'ny ADN ary olana maharitra (jereo ny Sary 1 sy 2). Amin'ireny tranga ireny, na dia ny fanasarahana sy fanadiovana tsara indrindra aza dia tsy hanampy.

Sary 1 | Fiantraikan'ny tsy fahafahana mihetsika amin'ny fahamarinan'ny ADN
Nasehon'ny electrophoresis gel agarose fa niovaova be ny kalitaon'ny ADN nalaina avy amin'ny fizarana paraffine tamin'ny autopsies. Hita tao amin'ny nalaina ny ADN misy halavan'ny sombin-javatra samihafa arakaraka ny fomba fametrahana azy. Voatahiry ny ADN rehefa napetraka tao anaty santionany mangatsiaka teratany sy tao anaty formaline tsy miandany misy buffer. Ny fampiasana formaline misy asidra formic misy Bouin dia nahatonga ny fahaverezan'ny ADN betsaka. Ny ampahany sisa dia potipotika be.
Eo ankavia, ny halavan'ny sombin-javatra dia aseho amin'ny kilobase pairs (kbp)

Sary 2 | Fahaverezan'ny fahamarinan'ny lasibatra asidra nokleika
(a) Ny elanelana 3′-5′ eo amin'ny kofehy roa dia hiteraka fahatapahan'ny ADN kendrena. Mbola hisy ihany ny fananganana ADN eo amin'ilay sombin-javatra kely. Na izany aza, raha tsy misy toerana fanafanana primer eo amin'ilay sombin-javatra ADN, dia ny fanamafisana lineary ihany no mitranga. Amin'ny tranga tsara indrindra, mety hifameno indray ireo sombin-javatra, saingy ho kely ny vokatra ary ho ambanin'ny haavon'ny fahitana.
(b) Ny fahaverezan'ny fotony, indrindra noho ny fanesorana ny loto sy ny fiforonan'ny dimeran'ny thymidine, dia mitarika fihenan'ny isan'ny fatorana H sy fihenan'ny Tm. Mandritra ny dingana fanafanana maharitra, dia hiempo hiala amin'ny ADN matrix ireo primer ary tsy hirehitra na dia amin'ny toe-javatra tsy dia henjana loatra aza.
(c) Ireo fotony timina mifanila dia mamorona dimera TT.
Olana iray mahazatra matetika mitranga amin'ny diagnostika molekiola ny famoahana asidra nokleika kendrena tsy dia tsara loatra raha oharina amin'ny fitrandrahana phenol-chloroform. Amin'ny tranga tafahoatra, mety mifandray amin'ny valiny diso ratsy izany. Azo tehirizina ny fotoana betsaka amin'ny alàlan'ny lysis mangotraka na ny fandevonan-kanina anzima ny poti-sela, saingy matetika ity fomba ity dia miteraka fahatsapana ambany amin'ny PCR noho ny tsy fahampian'ny famoahana asidra nokleika.

Fanakanana ny asan'ny polymerase mandritra ny fanamafisana

Amin'ny ankapobeny, ny fanakanana dia ampiasaina ho toy ny foto-kevitra ao anaty fitoeran-javatra mba hilazana ireo anton-javatra rehetra izay mitarika ho amin'ny valin'ny PCR tsy dia tsara loatra. Amin'ny heviny biochemika hentitra, ny fanakanana dia voafetra amin'ny asan'ny anzima, izany hoe, mampihena na misoroka ny fiovam-po amin'ny vokatra substrate amin'ny alàlan'ny fifandraisana amin'ny toerana mavitrika amin'ny ADN polymerase na ny cofactor-ny (ohatra, Mg2+ ho an'ny Taq ADN polymerase).
Ireo singa ao amin'ny santionany na ireo buffer sy nalaina isan-karazany misy reagents dia afaka manakana mivantana ny anzima na mamandrika ireo cofactors-ny (ohatra ny EDTA), ka mahatonga ny polymerase tsy miasa ary mitarika ho amin'ny fihenan'ny valin'ny PCR na ratsy diso.
Na izany aza, maro amin'ireo fifandraisana misy eo amin'ireo singa mihetsika sy ireo asidra nokleika misy lasibatra no antsoina koa hoe 'mpampidina PCR'. Raha vao simba noho ny fitokana-monina ny fahamarinan'ny sela ary avoaka ny asidra nokleika, dia mety hitranga ny fifandraisana eo amin'ny santionany sy ny vahaolana manodidina azy ary ny dingana mivaingana. Ohatra, ny 'mpanala' dia afaka mampiray ADN tokana na roa sosona amin'ny alàlan'ny fifandraisana tsy kovalanty ary manelingelina ny fitokana-monina sy ny fanadiovana amin'ny alàlan'ny fampihenana ny isan'ny lasibatra izay tonga amin'ny lalan-dràn'ny fihetsika PCR.
Amin'ny ankapobeny, ny PCR inhibitors dia hita ao amin'ny ankamaroan'ny tsiranoka sy reagents ao amin'ny vatana ampiasaina amin'ny fitiliana diagnostika klinika (urea ao amin'ny urine, hemoglobine ary heparin ao amin'ny ra), famenon-tsakafo (singa organika, glycogen, tavy, ions Ca2+) ary singa ao amin'ny tontolo iainana (phenols, metaly mavesatra).

Ireo mpanakana PCR miely patrana kokoa dia hita ao amin'ny bakteria sy sela eukaryotika, ADN tsy kendrena, makromolekiola mifamatotra amin'ny ADN amin'ny matrices sela ary fitaovana laboratoara toy ny fonon-tanana sy plastika. Ny fanadiovana ny asidra nokleika mandritra na aorian'ny fanesorana no fomba tsara indrindra hanesorana ireo mpanakana PCR.
Amin'izao fotoana izao, fitaovana fitrandrahana mandeha ho azy isan-karazany no afaka manolo ny protocole maro vita tanana, saingy tsy mbola tratra mihitsy ny famerenana sy/na fanadiovana 100% ny lasibatra. Mety mbola misy ireo mpanakana mety hitranga ao amin'ny asidra nokleika voadio na mety efa nisy fiantraikany. Misy paikady samihafa hampihenana ny fiantraikan'ny mpanakana. Ny fisafidianana ny polymerase mety dia mety hisy fiantraikany lehibe amin'ny asan'ny mpanakana. Ny fomba voaporofo hafa hampihenana ny fanakanana ny PCR dia ny fampitomboana ny fifantohana polymerase na ny fampiharana ireo akora fanampiny toy ny BSA.
Azo aseho amin'ny alalan'ny fampiasana ny fanaraha-maso ny kalitaon'ny dingana anatiny (IPC) ny fisakanana ny fihetsiky ny PCR.
Tsy maintsy mitandrina tsara ny fanesorana ireo akora sy vahaolana hafa rehetra ao anaty kitapo fitrandrahana, toy ny etanôla, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol ary phenol, amin'ny alalan'ny fanasana tsara. Miankina amin'ny fifantohany, mety hampandeha na hanakana ny PCR izy ireo.